ELISA

內(nèi)容大綱
什么是 ELISA？
作ELISA的四種方法
造成ELISA偽陽性、高背景值、無訊號的原因
ELISA的作流程
ELISA和PCR的差異是？

什么是 ELISA？

酵素鏈接免疫吸附法 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA），又稱酵素免疫分析 （enzyme immunoassay， EIA）、酶聯(lián)法，是一種靈敏、特異且廣泛應(yīng)用于生物學、生化學和醫(yī)學研究中的分子生物學分析技術(shù)。 其原理為在固體表面 （如微孔盤） 上，利用抗原及抗體間的專一性鍵結(jié)，以酵素標記的抗體或抗原，以檢測樣品中的目標分子。 而用以標記的酵素被稱為報道酵素，常見的有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， AP）等。
ELISA 相較于其它的免疫分析技術(shù)具有更多優(yōu)勢。 首先，相較于其他免疫學檢測技術(shù)，ELISA具有更高的靈敏度和專一性，可以檢測非常低濃度的生物分子，如蛋白質(zhì)、抗體和細胞因子等，并可區(qū)分相似的分子。 這使得ELISA在診斷疾病、監(jiān)測病情、檢測病原體等方面更加具有可信度和*度。
作上，ELISA作簡單、快速、容易自動化，可減少人工作的誤差，提高實驗的穩(wěn)定性和可重復性。 而且，ELISA所需的樣品量很小，能夠節(jié)省寶貴的樣品。 ELISA 亦常應(yīng)用于高通量 （high throughput） 檢測，同時檢測多種樣品，有效提高檢測效率、節(jié)省時間和成本。 同時，由于 ELISA 是一種非放射性的檢測方法，不存在輻射危害，符合環(huán)保和人體健康的要求。 基于以上優(yōu)勢，ELISA 被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生命科學研究等領(lǐng)域。

ELISA 依分析目的不同，可分為定性、定量及半定量生物分子

• 定性 （qualitative）：
  用于確定樣品中是否存在特定的生物分子，例如病原體抗原、抗體等。 通常使用單一抗體對樣品進行檢測，如果樣品中存在目標分子，就會產(chǎn)生信號; 反之，則不會產(chǎn)生信號。
• 定量（quantitative）：
  用于測量樣品中目標分子的濃度，通常使用標準曲線法（standard curve）進行定量。 在分析時，樣品的吸光值與標準曲線上的已知樣品濃度相對應(yīng)，就可以計算出樣品中目標分子的濃度。
• 半定量 （semi-quantitative）：
  是一種介于定性和定量之間的分析方法，通常用于測量樣品中目標分子的相對濃度。 其是將樣品與已知濃度的標準物質(zhì)進行比較，來估算樣品中目標分子的相對濃度。

作ELISA的四種方法

依不同作方法，ELISA 又可分為直接法 （Direct ELISA）、間接法 （Indirect ELISA）、三明治法 （Sandwich ELISA）、競爭法 （Competitive ELISA） 四種方法。

直接法 （Direct ELISA）

直接法通常用于檢測抗原，在過程中只需要使用到一種一級抗體 （primary antibody），不需要復雜的步驟即可偵測分析物 （analyte），為*簡單的 ELISA 方法。 其作方法是將目標抗原固定（coating; immobilizing） 于固體表面 （solid phase） 上，一般使用 96 孔微孔盤 （96-well plate），再使用酵素標記之一級抗體檢測待測抗原。 由于反應(yīng)過程單純，直接法可以快速分析結(jié)果，且不會產(chǎn)生二級抗體（secondary antibody）的非專一性交互反應(yīng)。 然而，也因為只使用到一種抗體，直接法無法放大檢測信號（signal amplification）、降低其偵測的靈敏度。 此外，試驗中的一級抗體都必須用酵素標記，相當耗時、耗成本。

間接法 （Indirect ELISA）

間接法是一種使用一級抗體與酵素標記的二級抗體進行結(jié)合的檢測方法，通常用于檢測未知的一級抗體。 其中，*常見的應(yīng)用實例是用于檢測艾滋病毒 （human immunodeficiency virus， HIV）。
這個方法的步驟是先將已知抗原固定在固體表面上，加入檢體，再加入酵素標記的二級抗體（secondary antibody），以偵測待測抗體。 由于使用了兩種抗體，因此間接法具有較高的靈敏度，且可使用多種一級抗體，在應(yīng)用上更具彈性。
然而，間接法中二級抗體間可能會發(fā)生交互作用，導致非專一性的信號產(chǎn)生，影響實驗結(jié)果的準確性。 為了解決這個問題，可以在實驗過程中加入阻斷液（blocking solution），減少非專一性的交互作用。 如此一來，間接法就能夠更準確地檢測待測抗體，并得到可靠的結(jié)果。

三明治法 （Sandwich ELISA）

三明治法是利用兩種抗體對檢體中的待測抗原進行兩次專一性辨認，因此具有高偵測靈敏度及高專一性。 家用驗孕試紙即是三明治法的應(yīng)用實例之一。 不過，此方法中的待測抗原須為多價抗原，以便與兩種或以上的專一性抗體結(jié)合。 與直接法和間接法不同的是，三明治法是將捕捉抗體（capture antibody）固定在固體表面上，再加入檢體，捕捉抗體會抓住檢體中具有專一性的抗原，再與一級抗體及酵素標記二級抗體反應(yīng)。 由于這個高度辨識的過程，檢體不需要事先進行純化，而可直接進行實驗。 然而，需要注意的是，在使用此方法時必須選用特定的一級抗體及二級抗體。 為了避免一級抗體跟二級抗體競爭與抗原結(jié)合的現(xiàn)象發(fā)生，必須確認一級抗體跟二級抗體具有不同的抗原表位（epitopes，即抗原上可與抗體結(jié)合的位置），且必須驗證一級抗體跟二級抗體可進行專一性結(jié)合，并可同時作用。

競爭法（ Competitive ELISA）

競爭法，又稱為競爭抑制ELISA （inhibition ELISA），是利用待測抗原與酵素標記的生物分子，競爭結(jié)合于固定在固體表面上的抗原或抗體。 若待測抗原在檢體中濃度越高，就會與越多抗體結(jié)合，導致有酵素標記之抗體結(jié)合少，呈色反應(yīng)訊號值亦越低，即待測抗原濃度與呈色反應(yīng)成反比。 一般多用于檢測半抗原（hapten）或小分子抗原。

造成ELISA偽陽性、高背景值、無訊號的原因

ELISA常面臨結(jié)果不穩(wěn)定的狀況，如偽陽性 （false positive）、高背景值 （high background）、無訊號或訊號太低 （no or low signal） 等。 而造成偽陽性或高背景值的原因，部份是由于未結(jié)合的抗體、抗原或是雜質(zhì)在各步驟間沒有被完全去除，從而導致背景信號或是非專一性的交互作用。

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ELISA的作流程

為了降低偽陽性及高背景值的可能性，ELISA各步驟間必須進行清洗（wash），借由此步驟去除非專一性或親和力低的反應(yīng)物干擾。 清洗液通常為磷酸鹽PBS緩沖溶液或TBS緩沖液，并可添加適當濃度的界面活性劑，如0.01%~0.1% Tween-20或Triton X-100 以降低樣品中的非專一性結(jié)合 。
清洗的過程非常重要。 一般而言，每個清洗步驟需以緩沖液清洗 2~5 次。 若使用人工手動清洗，則需注意甩凈殘留反應(yīng)液，并且于甩凈殘液后，盡快加入下一個步驟的反應(yīng)液，以避免微孔盤過度干燥，亦可運用工具例如微孔盤清洗機進行清洗，以加快清洗速度、避免交叉污染。

ELISA和PCR的差異是？

ELISA 及 PCR 都是分子生物學中常使用的分析技術(shù)，總的來說，兩者皆有其優(yōu)缺點，因此需要依據(jù)具體的應(yīng)用選擇要使用哪種技術(shù)。 以2019年造成全球疫情大流行的新冠肺炎（COVID-19）為例，ELISA及PCR都可以用來檢測冠狀病毒（coronavirus），但應(yīng)用上仍有些許差異。

因此，在流行病學中，利用 ELISA 搭配 PCR 檢測病毒或其它生物子，如猴痘病毒 （Monkeypox virus， MPV）、漢他病毒 （Hantavirus）、諾羅病毒 （Norovirus） 等，可以達到更全面的檢測效果。
另一種技術(shù)，則是將 ELISA 與 PCR 結(jié)合，為 PCR-ELISA。 此方法可以將固定于固體表面的DNA，直接以PCR定量DNA產(chǎn)物。 由于本篇主要探討 ELISA 之分析方法，本文將不針對 PCR-ELISA 進行討論。

ELISA常見應(yīng)用：

• 臨床醫(yī)學：癌癥、自體免疫疾病、傳染病等疾病的診斷
• 病毒檢測：冠狀病毒 （coronavirus， SARS-CoV-2）、艾滋病毒 （HIV）、西尼羅病毒 （West Nile Virus） 等
• 即時檢測：家用驗孕試劑
• 學術(shù)研究：DNA/RNA 定量、細胞信號傳遞、代謝途徑、基因表達和調(diào)控等
• 食品安全：食品過敏原