ELISA

內(nèi)容大綱
什么是 ELISA？
作ELISA的四種方法
造成ELISA偽陽(yáng)性、高背景值、無訊號(hào)的原因
ELISA的作流程
ELISA和PCR的差異是？

什么是 ELISA？

酵素鏈接免疫吸附法 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA），又稱酵素免疫分析 （enzyme immunoassay， EIA）、酶聯(lián)法，是一種靈敏、特異且廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、生化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的分子生物學(xué)分析技術(shù)。 其原理為在固體表面 （如微孔盤） 上，利用抗原及抗體間的專一性鍵結(jié)，以酵素標(biāo)記的抗體或抗原，以檢測(cè)樣品中的目標(biāo)分子。 而用以標(biāo)記的酵素被稱為報(bào)道酵素，常見的有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， AP）等。
ELISA 相較于其它的免疫分析技術(shù)具有更多優(yōu)勢(shì)。 首先，相較于其他免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，ELISA具有更高的靈敏度和專一性，可以檢測(cè)非常低濃度的生物分子，如蛋白質(zhì)、抗體和細(xì)胞因子等，并可區(qū)分相似的分子。 這使得ELISA在診斷疾病、監(jiān)測(cè)病情、檢測(cè)病原體等方面更加具有可信度和*度。
作上，ELISA作簡(jiǎn)單、快速、容易自動(dòng)化，可減少人工作的誤差，提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。 而且，ELISA所需的樣品量很小，能夠節(jié)省寶貴的樣品。 ELISA 亦常應(yīng)用于高通量 （high throughput） 檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)多種樣品，有效提高檢測(cè)效率、節(jié)省時(shí)間和成本。 同時(shí)，由于 ELISA 是一種非放射性的檢測(cè)方法，不存在輻射危害，符合環(huán)保和人體健康的要求。 基于以上優(yōu)勢(shì)，ELISA 被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生命科學(xué)研究等領(lǐng)域。

ELISA 依分析目的不同，可分為定性、定量及半定量生物分子

• 定性 （qualitative）：
  用于確定樣品中是否存在特定的生物分子，例如病原體抗原、抗體等。 通常使用單一抗體對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，如果樣品中存在目標(biāo)分子，就會(huì)產(chǎn)生信號(hào); 反之，則不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。
• 定量（quantitative）：
  用于測(cè)量樣品中目標(biāo)分子的濃度，通常使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（standard curve）進(jìn)行定量。 在分析時(shí)，樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線上的已知樣品濃度相對(duì)應(yīng)，就可以計(jì)算出樣品中目標(biāo)分子的濃度。
• 半定量 （semi-quantitative）：
  是一種介于定性和定量之間的分析方法，通常用于測(cè)量樣品中目標(biāo)分子的相對(duì)濃度。 其是將樣品與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，來估算樣品中目標(biāo)分子的相對(duì)濃度。

作ELISA的四種方法

依不同作方法，ELISA 又可分為直接法 （Direct ELISA）、間接法 （Indirect ELISA）、三明治法 （Sandwich ELISA）、競(jìng)爭(zhēng)法 （Competitive ELISA） 四種方法。

直接法 （Direct ELISA）

直接法通常用于檢測(cè)抗原，在過程中只需要使用到一種一級(jí)抗體 （primary antibody），不需要復(fù)雜的步驟即可偵測(cè)分析物 （analyte），為*簡(jiǎn)單的 ELISA 方法。 其作方法是將目標(biāo)抗原固定（coating; immobilizing） 于固體表面 （solid phase） 上，一般使用 96 孔微孔盤 （96-well plate），再使用酵素標(biāo)記之一級(jí)抗體檢測(cè)待測(cè)抗原。 由于反應(yīng)過程單純，直接法可以快速分析結(jié)果，且不會(huì)產(chǎn)生二級(jí)抗體（secondary antibody）的非專一性交互反應(yīng)。 然而，也因?yàn)橹皇褂玫揭环N抗體，直接法無法放大檢測(cè)信號(hào)（signal amplification）、降低其偵測(cè)的靈敏度。 此外，試驗(yàn)中的一級(jí)抗體都必須用酵素標(biāo)記，相當(dāng)耗時(shí)、耗成本。

間接法 （Indirect ELISA）

間接法是一種使用一級(jí)抗體與酵素標(biāo)記的二級(jí)抗體進(jìn)行結(jié)合的檢測(cè)方法，通常用于檢測(cè)未知的一級(jí)抗體。 其中，*常見的應(yīng)用實(shí)例是用于檢測(cè)艾滋病毒 （human immunodeficiency virus， HIV）。
這個(gè)方法的步驟是先將已知抗原固定在固體表面上，加入檢體，再加入酵素標(biāo)記的二級(jí)抗體（secondary antibody），以偵測(cè)待測(cè)抗體。 由于使用了兩種抗體，因此間接法具有較高的靈敏度，且可使用多種一級(jí)抗體，在應(yīng)用上更具彈性。
然而，間接法中二級(jí)抗體間可能會(huì)發(fā)生交互作用，導(dǎo)致非專一性的信號(hào)產(chǎn)生，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 為了解決這個(gè)問題，可以在實(shí)驗(yàn)過程中加入阻斷液（blocking solution），減少非專一性的交互作用。 如此一來，間接法就能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)待測(cè)抗體，并得到可靠的結(jié)果。

三明治法 （Sandwich ELISA）

三明治法是利用兩種抗體對(duì)檢體中的待測(cè)抗原進(jìn)行兩次專一性辨認(rèn)，因此具有高偵測(cè)靈敏度及高專一性。 家用驗(yàn)孕試紙即是三明治法的應(yīng)用實(shí)例之一。 不過，此方法中的待測(cè)抗原須為多價(jià)抗原，以便與兩種或以上的專一性抗體結(jié)合。 與直接法和間接法不同的是，三明治法是將捕捉抗體（capture antibody）固定在固體表面上，再加入檢體，捕捉抗體會(huì)抓住檢體中具有專一性的抗原，再與一級(jí)抗體及酵素標(biāo)記二級(jí)抗體反應(yīng)。 由于這個(gè)高度辨識(shí)的過程，檢體不需要事先進(jìn)行純化，而可直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 然而，需要注意的是，在使用此方法時(shí)必須選用特定的一級(jí)抗體及二級(jí)抗體。 為了避免一級(jí)抗體跟二級(jí)抗體競(jìng)爭(zhēng)與抗原結(jié)合的現(xiàn)象發(fā)生，必須確認(rèn)一級(jí)抗體跟二級(jí)抗體具有不同的抗原表位（epitopes，即抗原上可與抗體結(jié)合的位置），且必須驗(yàn)證一級(jí)抗體跟二級(jí)抗體可進(jìn)行專一性結(jié)合，并可同時(shí)作用。

競(jìng)爭(zhēng)法（ Competitive ELISA）

競(jìng)爭(zhēng)法，又稱為競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA （inhibition ELISA），是利用待測(cè)抗原與酵素標(biāo)記的生物分子，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于固定在固體表面上的抗原或抗體。 若待測(cè)抗原在檢體中濃度越高，就會(huì)與越多抗體結(jié)合，導(dǎo)致有酵素標(biāo)記之抗體結(jié)合少，呈色反應(yīng)訊號(hào)值亦越低，即待測(cè)抗原濃度與呈色反應(yīng)成反比。 一般多用于檢測(cè)半抗原（hapten）或小分子抗原。

造成ELISA偽陽(yáng)性、高背景值、無訊號(hào)的原因

ELISA常面臨結(jié)果不穩(wěn)定的狀況，如偽陽(yáng)性 （false positive）、高背景值 （high background）、無訊號(hào)或訊號(hào)太低 （no or low signal） 等。 而造成偽陽(yáng)性或高背景值的原因，部份是由于未結(jié)合的抗體、抗原或是雜質(zhì)在各步驟間沒有被完全去除，從而導(dǎo)致背景信號(hào)或是非專一性的交互作用。

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ELISA的作流程

為了降低偽陽(yáng)性及高背景值的可能性，ELISA各步驟間必須進(jìn)行清洗（wash），借由此步驟去除非專一性或親和力低的反應(yīng)物干擾。 清洗液通常為磷酸鹽PBS緩沖溶液或TBS緩沖液，并可添加適當(dāng)濃度的界面活性劑，如0.01%~0.1% Tween-20或Triton X-100 以降低樣品中的非專一性結(jié)合 。
清洗的過程非常重要。 一般而言，每個(gè)清洗步驟需以緩沖液清洗 2~5 次。 若使用人工手動(dòng)清洗，則需注意甩凈殘留反應(yīng)液，并且于甩凈殘液后，盡快加入下一個(gè)步驟的反應(yīng)液，以避免微孔盤過度干燥，亦可運(yùn)用工具例如微孔盤清洗機(jī)進(jìn)行清洗，以加快清洗速度、避免交叉污染。

ELISA和PCR的差異是？

ELISA 及 PCR 都是分子生物學(xué)中常使用的分析技術(shù)，總的來說，兩者皆有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此需要依據(jù)具體的應(yīng)用選擇要使用哪種技術(shù)。 以2019年造成全球疫情大流行的新冠肺炎（COVID-19）為例，ELISA及PCR都可以用來檢測(cè)冠狀病毒（coronavirus），但應(yīng)用上仍有些許差異。

因此，在流行病學(xué)中，利用 ELISA 搭配 PCR 檢測(cè)病毒或其它生物子，如猴痘病毒 （Monkeypox virus， MPV）、漢他病毒 （Hantavirus）、諾羅病毒 （Norovirus） 等，可以達(dá)到更全面的檢測(cè)效果。
另一種技術(shù)，則是將 ELISA 與 PCR 結(jié)合，為 PCR-ELISA。 此方法可以將固定于固體表面的DNA，直接以PCR定量DNA產(chǎn)物。 由于本篇主要探討 ELISA 之分析方法，本文將不針對(duì) PCR-ELISA 進(jìn)行討論。

ELISA常見應(yīng)用：

• 臨床醫(yī)學(xué)：癌癥、自體免疫疾病、傳染病等疾病的診斷
• 病毒檢測(cè)：冠狀病毒 （coronavirus， SARS-CoV-2）、艾滋病毒 （HIV）、西尼羅病毒 （West Nile Virus） 等
• 即時(shí)檢測(cè)：家用驗(yàn)孕試劑
• 學(xué)術(shù)研究：DNA/RNA 定量、細(xì)胞信號(hào)傳遞、代謝途徑、基因表達(dá)和調(diào)控等
• 食品安全：食品過敏原